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小鼠脾臟細胞分離方法

更新時間:2023-05-22   點擊次數:127次

脾臟處理

1.將兩個已解剖分離的脾臟,置于一個15 mL離心管頂部配備的70 μm細胞篩網上。使用無菌注射器的柱塞,以溫和力度將脾組織壓碎以通過細胞篩網進行勻漿處理,確保不破壞細胞結構。在整個過程中,分次使用總計6 -10mL的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基,逐步沖洗篩網以收集細胞。2.將收集到的細胞懸液以500 × g離心5分鐘,隨后,小心地去除上清液,并將細胞沉淀重懸于5 mL的紅細胞裂解緩沖液中,在室溫下靜置孵育5分鐘。孵育結束后,迅速加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)以終止紅裂過程,再次以500 × g離心5分鐘。若沉淀中仍有殘留紅細胞,需重復上述裂解和洗滌步驟,直至肉眼所見無紅色。3.細胞計數與活力檢測:完成裂解后,以500 × g離心5分鐘,丟棄上清液,然后將細胞沉淀用1 mL PBS重新懸浮。接下來,采用臺盼藍排除法鑒別活細胞,在血細胞計數板上進行精確的細胞計數,以確定活細胞的數量。這種方法基于臺盼藍無法穿透活細胞膜而能夠染色死細胞的原理,從而區分出活細胞和死細胞的比例及總數。4. 通過流式檢測抗體標記的脾臟細胞。尤其需要注意一點,對于脾臟巨噬細胞的流式檢測,在抗體標記前,需要Fc受體的封閉,避免非特異染色。5. 大家拿到自己的流式結果后,如果實驗結果不符合自己的預期。這時最需要做的就是質控自己的流式數據,比如細胞的分群,大概比例,細胞的死活,細胞的數量,分群是不是集中,一定要找文獻,無論如何,對照組的正常小鼠,這個數據是可以參考的。如果自己的流式數據對著文獻都不太符合常規,就不要給給實驗下結論。這時,基礎的實驗體系就有問題。

小鼠脾臟細胞分離方法

小鼠脾臟細胞分離方法

6. 對于巨噬細胞,CD11b和F4/80雙標,肝臟和脾臟,還有腹腔,肯定會有三群(根據這兩個maker的表達高低)。對于很多用荷蘭liposoma品牌的巨噬細胞清除劑clodronateliposomes氯膦酸二鈉脂質體的客戶來說,清除組和對照組,也可以參考這個圖。


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