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懸浮細胞如何固定做免疫熒光?

更新時間:2022-11-29   點擊次數:123次

懸(xuan)(xuan)浮細胞(bao)總是(shi)在孵抗體(ti)和洗的時(shi)候被(bei)沖掉,懸(xuan)(xuan)浮細胞(bao)做免疫(yi)熒光怎么固定?


傳統(tong)方法(fa)

實驗步驟:

1. 細胞在冰浴中冷卻(que),然后用臺式離(li)心機(ji)于4℃以800 g 離(li)心5 min,吸(xi)去培養液并(bing)以4℃PBS重懸細胞。

2. 離心吸去PBS,以1~2 ml 2%PFA固(gu)定(ding)液(ye),或2%PFA固(gu)定(ding)液(ye)/0.1% Triton X-100重懸細(xi)胞,置冰上固(gu)定(ding)30 min。

3. 離(li)心(xin)、吸(xi)去固定液,用15 ml 4℃ PBS重懸細(xi)(xi)胞,放5 min 后(hou),用PBS再次洗(xi)滌細(xi)(xi)胞。

4. 稀釋的(de)第一(yi)抗體(ti)于4℃用微量離(li)心(xin)機(ji)以13 500 g 離(li)心(xin)2 min,250 μl 抗體(ti)足(zu)夠用于5x106細胞。

5. 離心細胞(bao),吸去PBS,重懸細胞(bao)于第(di)一抗體中(zhong),置4℃溫育1 h。

6. 用4℃ PBS稀釋細胞(bao)和抗(kang)體至15 ml。

7. 離(li)心,吸去PBS,以4℃ PBS重懸細(xi)胞,重復(fu)1次。

8. 第二(er)抗體4℃用微(wei)量離心機以13 500 g 離心2 min,5x106細胞用250 ul 抗體足夠。

9. 吸去PBS,以(yi)第二抗體重懸細胞,4℃溫育1 h,重復步(bu)驟6及步(bu)驟7。

10. 除(chu)非立即觀(guan)察細(xi)胞(bao),否則(ze)在進行細(xi)胞(bao)濃縮的下一(yi)步操作之前(qian)應以鋁萡包裹(guo)離心(xin)管(guan)并冷藏。

11. 離(li)心細(xi)胞(bao)并以少量PBS重懸(勿用水),將細(xi)胞(bao)懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層(ceng)的載玻片(pian)上,加上蓋(gai)玻片(pian),盡可(ke)能馬上觀察結果。 

鏡下觀察(cha):沒有細胞,原來掉片(pian)了!!!

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