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AIM自誘導培養基介紹

更新時間:2022-11-29   點擊次數:180次

自誘導培養基(lac啟(qi)動子(zi))(Auto-induction Medium)產品及(ji)特點
本(ben)產品是在(zai)pET專用生長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)的(de)基(ji)礎上(shang)開發而成(cheng)的(de),它(ta)利用E.coli自身(shen)對(dui)培(pei)養(yang) 基(ji)中碳源(yuan)和(he)能源(yuan)的(de)調控(kong)利用機(ji)制,實現外源(yuan)蛋白(bai)在(zai)細菌達到飽和(he)期后的(de)自動誘發。
具有下列特點(dian):
1. 不需添加任何IPTG或相關誘導物,節約成本(ben)。
2. 免去了密切監控菌(jun)液密度的過程,尤其適合大規模篩(shai)選(xuan) 。
3. 細菌(jun)生長(chang)密度遠高于IPTG誘(you)導表達系(xi)統 。
4. 外源(yuan)蛋白表(biao)達量遠(yuan)遠(yuan)高(gao)于IPTG誘導表(biao)達系統(tong)。
5. 本產品即開即用(yong),操作簡單(dan) 。
6. 與(yu)各種細胞培養容器兼容(如(ru)培養瓶、培養罐(guan)、深孔管、發(fa)酵(jiao)罐(guan)等)。


自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)操作步(bu)驟

(一(yi))獲得(de)目的基因

1、通過PCR方法:以(yi)含目的(de)基(ji)(ji)因的(de)克隆質(zhi)粒為(wei)模板,按基(ji)(ji)因序列(lie)設計(ji)一對引(yin)(yin)物(wu)(wu)(在上游和(he)下游引(yin)(yin)物(wu)(wu)分別引(yin)(yin)入不同的(de)酶切位點),PCR循(xun)環獲得所需(xu)基因片段。

2、通(tong)過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xi)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄(lu)形(xing)成cDNA第一(yi)鏈,以逆(ni)轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

(二)構建重組(zu)表達載體(ti)

1自(zi)誘導(dao)培(pei)養基(ji)(lac啟(qi)動子)(Auto-induction Medium)載(zai)體(ti)酶切(qie)(qie):將(jiang)表達質(zhi)粒用(yong)限制(zhi)性內切(qie)(qie)酶(同引物的酶切(qie)(qie)位點)進行雙酶切(qie)(qie),酶切(qie)(qie)產物行瓊脂糖電泳后,用(yong)膠(jiao)回收(shou)Kit或凍融(rong)法回(hui)收載體大片段。

2PCR產物雙酶切后回收(shou),在T4DNA連接酶作用下連接入載體(ti)。

(三)  獲得含重組表(biao)達(da)質粒的表(biao)達(da)菌種

1 將連(lian)接產(chan)物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載(zai)體的(de)標志(zhi)(抗Amp或藍白(bai)斑)作篩選(xuan),挑取單斑,堿裂(lie)解(jie)法小量抽(chou)提質(zhi)粒,雙酶切初步鑒定。

2 測序驗證目的基(ji)因的插入方向及閱讀(du)框架(jia)均正確,進入下步操(cao)作。否則應(ying)篩選更(geng)多克(ke)隆,重(zhong)復亞克(ke)隆或(huo)亞克(ke)隆至(zhi)不同(tong)酶切(qie)位點。

3 以此重組質粒DNA轉化表(biao)達宿主菌的感(gan)受態細胞。

(四)誘導表達

1 自誘(you)導(dao)培養(yang)基(lac啟(qi)動子(zi))(Auto-induction Medium)挑取含重(zhong)組質粒的菌體單斑(ban)至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yang)。

2、按(an)150比例稀釋過夜菌,一(yi)般將1ml菌加入到(dao)含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培(pei)養至OD6000.4-1.0(*0.6,大約需(xu)3hr)。

3、取部分液體作為(wei)未誘(you)導的對照組,余下的加入(ru)IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為(wei)實(shi)驗組(zu),兩組(zu)繼續37℃震蕩(dang)培養3hr

4、分別取菌(jun)體(ti)1ml, 離心12000g×30s收(shou)獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸(xuan),混勻(yun), 7010min

5、離心12000g×1min,取上清(qing)作為樣品,可做SDS-PAGE等分(fen)析。



自誘導培養基常見種類





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