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懸浮細胞的培養細節及免疫熒光IF經驗分享

更新時間:2022-06-04   點擊次數:906次

細胞培養類型可以分為貼壁細胞和懸浮細胞兩種,只有極少數類型細胞同時存在兩種狀態。

懸浮細胞是指不需要依賴支持物,可在培養基中以懸浮狀態生長的一類細胞,如淋巴細胞和大部分血液系統來源細胞。(如小鼠白血病細胞WEHI-3, 人白血病細胞K-562, HL-60)。工業上也有越來越多的貼壁傳代細胞被馴化出來,進行全懸浮的培養。目前在工業中應用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293細胞等,它們主要用于重組蛋白質生產;在獸用生物制品中常用的傳代細胞主要有采用全懸浮培養的BHK21細胞、MDCK細胞;及借助微載體懸浮培養的Vero細胞、PK細胞、ST細胞、 Marc145細胞等,每種細胞的特性都不同。

一般情況下,懸浮細胞相較于貼壁細胞的處理更加簡單一些,因為懸浮細胞傳代時無須胰酶消化。但這并不意味著懸浮細胞比貼壁細胞好養,對新手來說,反而更具挑戰性。總是會遇到各種各樣的問題:比如,為什么總是出現死細胞和細胞分化;說好了傳代很easy的,結果會出現分化;養好了凍存復蘇后又出現問題了!


養好懸浮細胞,有如下大眾經驗分享。


要點一:足夠的耐心,這是非常必要的

很多懸浮細胞在剛從凍存狀態復蘇時活力是相對較差的,此時我們需要有足夠的耐心,等待細胞完成自我修復進入對數增長期。比如THP-1(人單核細胞白血病)從解凍到恢復正常增殖往往需要7-10天的恢復期;Jurkat,Clone E6-1(人T淋巴細胞白血病細胞)復蘇后也需要5-7天才能恢復到凍存前的狀態。新手可能會在此期間放棄培養,所以,請多一點耐心哦!培養這類細胞也是培養耐心的過程呢!

要點二:接種密度的把握

一般來說,懸浮細胞接種時密度不應低于50萬個/ML,很多懸浮細胞有密度依賴,密度低導致的不增殖也是新手常見問題之一。當然,有極少數細胞在密度高時反而狀態變差,如W6/32(小鼠B細胞雜交瘤細胞)。因此,培養不了解的細胞前查找相關資料去掌握細胞特性非常重要。


要點三:換液方法及頻率

換液頻率不應該被限制得“明明白白",細胞是活物,在一個連續培養周期內,視細胞生長狀態可分多次添加補充培養基、葡萄糖等特定營養成份,維持細胞良好的生長狀態。懸浮培養過程中,隨著細胞的增殖,原有培養基中營養物質的消耗,代謝產物的增加,細胞的活率會下降,及時補充營養物質,使細胞處于一個相對良好的生存環境。切忌頻繁離心換液。參考換液方法:

①離心全換液法

即通過離心(800-1000rpm,5min)去除全部舊的培養基,更換新鮮培養基。該方法適合“皮實“好養的懸浮細胞換液(如K562),或者當前細胞狀態良好、密度較高導致培養基消耗較大的情況。此方法的優點是換液到位,能去除部分細胞碎片,但是同樣會對細胞造成一定程度的機械損傷。

②離心半換液法

即通過離心(800-1000rpm,5min)50%細胞懸液,更換50%體積的新鮮培養基。該方法適合比較“矯情“難養的細胞(如thp-1),或者正在調整狀態中、密度較低但碎片較多需要去除的情況。

③沉降換液法

即不使用離心機而是利用重力自然沉降的方法,將培養基與細胞分離,達到全部或部分更換新鮮培養基。但是其有應用局限性—只適合能成一定大小細胞團(否則無法自然沉降,只能低速離心)的細胞,尤其是處理依賴細胞聚集才能增殖的細胞時非常值得推薦,如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機械損傷,同時保留聚集的細胞團,并且去除細胞碎片也較為干凈。


固定懸浮細胞,有如下私房經驗分享。


養好懸浮細胞,需要用化合物等試劑刺激懸浮細胞,或者共培養。使用免疫熒光來檢查懸浮細胞,一直給很多新手,甚至高手造成心理陰影。如何固定好懸浮細胞?如何確保不掉片?甚至如何讓懸浮細胞貼壁來做實驗?是很多實驗者的奢望。懸浮細胞固定/免疫熒光專用玻片給帶來解決方案。


如下是一些懸浮細胞固定后做的免疫熒光圖片,可以參考。



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